在許多領域應用中，飛時測距質譜儀(TOF MS)已成為一種非常重要的儀器，特別是在臨床微生物實驗室的細菌鑑定中，其具有不可替代的作用。TOF MS的核心是低雜訊、高速類比數位轉換器(ADC)。本文將闡述TOF MS的基本原理並重點說明其關鍵參數，以及分析探討了TOF MS參數和ADC規格參數之間的關係。使用混合訊號前端(MxFE®) ADC的實際結果顯示，低雜訊、高速ADC可以大幅改善TOF MS的指標，包括品質精度、品質解析度和靈敏度。
TOF MS簡介
質譜測定(MS)為一種根據分子量對樣品中已知/未知分子進行量化的分析技術。先將樣品中的元素和/或分子電離成具有或不具有碎片的氣態離子，然後在品質分析儀中將其分離，如此便可以透過質譜中的質荷比（m/z，或脈衝的位置）及相對豐度（或脈衝的幅度）來表徵元素和/或分子。
質譜儀有三個主要組件：用於從被測樣品中產生氣態離子的離子源，根據m/z比分離離子的品質分析儀，以及用於檢測離子和每種離子相對豐度的離子檢測器。檢測器輸出經過處理和數位化處理後，產生質譜。目前有多種品質分析器採用完全不同的策略來分離不同m/z值的離子1。圖1顯示了四極桿和TOF MS的主要模組。
在TOF MS中，短時電離事件形成的離子透過靜電場加速，因此不同m/z的離子具有相同的動能，但速度不同。這些離子隨後沿著無場漂移路徑行進，並以不同的飛行時間到達檢測器——較輕的離子先於較重的離子到達，如圖2所示。在實踐中，由於加速區域中初始空間分佈和能量（或速度）的差異，相同m/z的一組離子的飛行時間會分佈形成一個窄至幾百皮秒(ps)的脈衝。每個脈衝是對應於多個獨立離子到達事件的訊號之和，通常由半峰全寬(FWHM)參數來表徵。
圖1:四極桿和TOF MS的主要模組
圖2:飛行時間品質分析儀圖解
檢測器（例如微通道板(MCP)檢測器）檢測傳入的離子並產生脈衝電流。電流由時間數位轉換器(TDC)或高速ADC記錄。雖然TDC的速度極快，可以低至幾皮秒，但其用於記錄脈衝幅度的動態範圍有限。高速ADC可以實現2 GSPS或更高的速度，解析度可達10位元、12位元甚至更多位數，因此可以準確記錄脈衝的時序和幅度。我們接下來將介紹影響TOF MS性能的高速ADC的重要規格參數。
TOF MS的應用
自20世紀90年代基質輔助鐳射解吸電離(MALDI)技術發明並商業化以來，TOF MS引起了人們的廣泛關注2。MALDI技術的原理如下：電離基質分子（通常是有機酸），同時利用數百皮秒至幾奈秒(ns)的紫外線(UV)雷射脈衝蒸發樣品分子。在氣相中，基質分子將質子傳遞給樣品分子，使樣品分子質子化並變成帶電離子。由於基質吸收了大部分鐳射能量，因此樣品中的分子會保持其完整性，而不會碎裂或分解，這使MALDI成為生物大分子分析領域備受矚目的電離方法。由於MALDI和TOF MS之間易於耦合、不受限的品質範圍、高靈敏度和高輸送量，TOF MS已成為生物醫學研究、藥物研發和臨床應用的重要工具，這些應用中的分析物通常是大分子。
值得注意的是，MALDI TOF MS在臨床細菌鑑定中發揮著不可取代的作用，其最快周轉時間為4小時，而常規技術或其他新技術需要72小時以上3。短周轉時間對於細菌感染患者的護理和治療結果非常重要。MALDI TOF MS的其他優點包括：樣品製備容易，操作成本低，以及有可能識別一些稀有細菌。隨著抗菌素耐藥性對世界各地的人類健康構成重大威脅，將MALDI TOF MS作為即時檢測(PoC)裝置是大勢所趨4。
TOF MS的關鍵參數
TOF MS定量分析測試樣品中不同分析物的能力取決於許多因素，包括樣品電離方法的選擇、用於加速和引導離子進入離子檢測器的電場的配置和時序特性、檢測器效率及訊號數位化。我們的討論僅限於與訊號數位化相關的TOF MS關鍵規格參數，包括品質範圍、品質精度、品質解析度、重複率和靈敏度。
品質範圍是樣品中分子的分子量範圍，與加速電壓、飛行管長度、採樣速率和重複率等多個因素有關。品質範圍要求因應用而異。例如，MALDI TOF MS進行細菌鑑定的測量品質範圍為2,000 Da至20,000 Da的核糖體標記。
品質基於飛行時間來計算，因此TOF MS的品質精度主要取決於脈衝時間測量的精度。實際上，每個脈衝的到達時間是透過將脈衝擬合到高斯函數並找到峰值來計算的。ADC採樣速率決定單個脈衝的採樣數，對於脈衝擬合非常重要。
品質解析度衡量光譜中兩個相鄰脈衝之間最接近的可區分間隔。其通常被定義為離子品質與相應品質脈衝寬度的比值。脈衝寬度的典型定義是FWHM。脈衝越窄，品質解析度越高，表示更能區分分子量相近的兩個離子包。雖然正交加速和反射器可以顯著提高品質解析度，但ADC採樣速率和雜訊性能也會影響此一關鍵規格。
在TOF MS中，質譜是來自許多次重複的訊號的總和，而不是僅包括單一過程（電離、加速和漂移、離子檢測和數位化）的單個瞬態。更重要的是，對於包含分子量和濃度不同的多種分子的測試樣品，單一電離事件可能既不會產生所有感興趣分子的離子，也不會產生與其濃度成比例的離子。求和是降低此類採樣誤差並提高訊號雜訊(SNR)的有效且實用的方法。因此，就訊號雜訊和輸送量而言，重複率是TOF MS的一個重要且實用的規格參數。新型TOF MS可以實現1 kHz或更快的掃描速度，表示每個瞬態只需1毫秒(ms)或更短的時間。提高ADC採樣速率會縮短每個瞬態的持續時間，進而實現更快的重複率。
TOF MS的靈敏度是指檢測樣品中最低濃度分子的能力。其由許多因素共同決定，例如：化學背景雜訊、所有目標分子的濃度範圍、檢測器和ADC的雜訊係數和動態範圍，以及求和得到最終質譜的瞬態數量。在實踐中，系統靈敏度可以透過識別瓶頸因素和/或平衡這些因素來優化。
TOF MS的理想ADC規格要求
低雜訊、高速ADC對於TOF MS的系統性能非常重要。如前所述，時間測量精度和系統雜訊水準是TOF MS儀器的兩個重要規格參數。系統雜訊水準可以通過重複測量並求和來變通處理，但時間測量的精度由高速ADC的採樣速率和孔徑抖動決定。考慮到在採用正交加速和反射器的TOF MS儀器中，脈衝可以窄至幾百皮秒，因此在5 GSPS採樣速率下，單個脈衝只有幾個樣本。將樣本擬合到高斯函數時，每個樣本對於找到脈衝峰值都很重要。因此，採樣速率和孔徑抖動是值得關注的ADC規格參數。
靈敏度由系統雜訊水準決定，而系統雜訊水準可以透過重複測量並求和來改善。然而，重複次數會限制儀器的輸送量。為了以較少的重複次數實現目標靈敏度，ADC的雜訊性能非常重要。人們常常對ADC的性能存在誤解，認為其SNR與其位解析度成正比。採樣速率為1 GSPS或以上的ADC通常採用流水線架構，其規格參數包括有效位元數(ENOB)和雜訊密度/雜訊係數/SNR等。然而，流水線型ADC有幾個缺點，包括：降低誤差需要高增益和大頻寬運算放大器，電容失配，以及前端採樣保持(S/H)和運算放大器的功耗；這些因素都會產生雜訊，導致其無法實現所需的位解析度5。ENOB取決於輸入頻率和採樣速率，透過失真率(SNDR)進行計算。例如，12位AD9081在4 GSPS和4500 MHz輸入頻率下具有8位元ENOB。ENOB並不是衡量ADC雜訊性能的良好指標。雜訊密度更接近實際雜訊水準，但採用高斯脈衝進行基準測試可以得到ADC雜訊性能以及TOF MS儀器靈敏度的真實情況。
低雜訊、高速ADC的基準測試
MxFE可智慧整合RF ADC、數位類比轉換器(DAC)、晶片內數位訊號處理和時脈/鎖相迴路(PLL)，支援多晶片同步。市場上也有僅配備高速ADC的MxFE元件。為了簡化起見，我們的基準測試使用了AD9082，其整合了ADC和DAC，如圖3所示。整合DAC用於產生FWHM為0.5 ns的窄高斯脈衝串，其幅度由數位縮放和外部衰減器組合來控制。高斯脈衝比用於ADC表徵的典型單音訊號更接近質譜中的訊號。設定兩個ADC通道對訊號進行數位化處理：CH1針對透過改變外部衰減器使之飽和或衰減的各種幅度；CH2作為參考，用於高於90%滿量程(FS)且未飽和的訊號強度。在我們的測試中，採樣速率為6 GSPS，以便為每個脈衝提供足夠的樣本。
圖3:使用AD9082進行高速ADC測試的框圖
我們進行了三種類型的測試：
• 衰減和飽和測試：CH2以固定7 dB衰減器對作為參考；CH1針對衰減情況使用8 dB、9 dB和10 dB衰減器對，針對飽和情況使用3 dB和1 dB衰減器對。
• 最大20 dB衰減的弱訊號測量：CH2直接連接到DAC輸出作為參考，縮放-16 dBFSC；CH1將10 dB衰減器對用於<32% FS訊號，將20 dB衰減器對用於<10% FS訊號。
• 雜訊測量：CH2以固定7 dB衰減器對作為參考；CH1使用50 Ω端接電阻。
對於每次測試，我們採集>10 µs數據，並重複進行資料擷取10次以檢查重現性。我們在MATLAB®中基於資料繪製曲線並進行分析。對於每種測試情況，將10次重複採集資料進行對比並繪製曲線。圖4顯示了測試中的單個脈衝，其中CH1比CH2低3 dB。兩個通道的10次重複採集完全重疊，表示資料擷取具有高重現性。
圖4:10次重複採集重疊表明資料獲取具有高重現性
AD9082 ADC具有超載保護電路，如果輸入幅度超過上限，此電路將會啟動。如果保護電路被啟動，則在脈衝的降緣通常會出現恢復拖尾，進而導致FS處出現峰值削波和恢復拖尾。較短的恢復拖尾對於時間精度很重要，因此對於TOF MS的品質測量也很重要。圖5顯示了飽和（最高6 dB）或衰減的五種情況的曲線。對於6 dB飽和，恢復拖尾小於0.4 ns，顯示保護電路啟動時恢復展寬極小。
為了測試弱輸入下的ADC性能，我們採集了衰減10 dB和20 dB的訊號，如圖6所示。訊號的清晰跡線是在10% FS，即衰減20 dB，顯示ADC產生的雜訊極小。
對於ADC雜訊基準，CH1連接了50 Ω端接電阻，而CH2保持在>90%FS，如圖7所示。
透過繪製長條圖並計算標準差來分析雜訊資料，如圖8所示。此情況的標準差為0.0025，顯示FS時的SNR為52 dB。
圖5:五種測試情況（飽和或過度衰減）的重疊狀態
圖6:輸入衰減10 dB和20 dB的測試情況
圖7:雜訊基準測量，CH1連接50 Ω端接電阻
圖8:本底雜訊（CH1，左）和FS訊號（CH2，右）測量結果長條圖
為了進一步量化時間測量精度和雜訊性能，我們對每個脈衝進行分段，峰值位於一個30 ns視窗的中心。然後，使用高斯模型擬合每個脈衝，以測量其FWHM。使用30 ns視窗中每側12ns的資料（總共24 ns）作為雜訊計算的基線。
圖9顯示了輸入為10% FS的測試情況的完整採集圖，以及使用高斯擬合和分段基線的單一脈衝放大圖。表1列出了平均值、測得的FWHM和計算的SNR。
圖9:輸入為10% FS的測試情況下進行FWHM和SNR測量的脈衝和基線分段
表1:輸入為10% FS的測試情況下測得的FWHM和SNR
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CH #
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FWHM (ns)
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SNR (dB)
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平均值
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SD
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平均值
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SD
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CH1 (20 dB)
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0.6722
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0.0141
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32.07
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0.468
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CH2 (0 dB)
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0.6657
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0.0056
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40.98
|
0.203
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測量了輸入衰減從1 dB到20 dB的所有測試情況下的FWHM和SNR。測試結果總結列於表2中。結果顯示，在不同輸入幅度下，時間測量準確，FWHM讀數一致。
表2:測得的FWHM和SNR
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Cases
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FWHM (ns) CH1/CH2
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SNR (dB) CH1/CH2
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||
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平均值
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SD
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平均值
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SD
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CH1=8 dB,
CH2=7 dB |
0.6543/0.6531
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0.0050/0.0028
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46.21/47.28
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0.275/0.363
|
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CH1=9 dB,
CH2=7 dB |
0.6656/0.6532
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0.0037/0.0024
|
46.24/47.22
|
0.408/0.439
|
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CH1=10 dB,
CH2=7 dB |
0.6549/0.6520
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0.0028/0.0024
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47.44/47.05
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0.587/0.273
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CH1=10 dB,
CH2=0 dB |
0.6708/0.6652
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0.0075/0.0044
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41.72/41.02
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0.556/0.248
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CH1=20 dB,
CH2=0 dB |
0.6722/0.6657
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0.0141/0.0056
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32.07/40.98
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0.468/0.203
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討論和總結
隨著MALDI TOF MS成為臨床微生物實驗室細菌鑑定的標準手段，以及人們對適用於個性化醫療的蛋白質組學的興趣日益濃厚，在未來幾十年內，MALDI TOF MS在醫療健康領域中的應用預計將繼續保持成長態勢。由於其對各種分子量的分子能夠實現無損分析的優勢，TOF MS在生物醫學和藥物研發、食品安全、環境監測方面也有廣泛的應用。低雜訊、高速ADC具有卓越的雜訊性能，採樣速率比目前一代TOF MS儀器中的ADC快3至6倍，因而是下一代高性能TOF MS儀器的關鍵元件。高採樣速率有助於縮短飛行管的長度，從而減輕真空系統的負擔，因此可以減小TOF MS儀器的尺寸而不影響性能。更精巧的尺寸對於TOF MS的即時檢測(PoC)應用和各種現場應用非常重要。
AD9082的基準測試存在侷限性，包括：用於創建低幅度輸入（例如1% FS或40 dB衰減）測試情況的外部衰減器非常有限，阻抗失配導致資料中的反射，以及沒有遮罩電磁干擾的開放空間。測試情況中報告的SNR低於實際值，因為雜訊計算中未消除由阻抗失配引起的基線反射。MxFE評估板和圖形化使用者介面(GUI)軟體可用於執行更密集的測試。根據詳細說明並配合現場演示有助於建立客戶評估系統。在經驗豐富的應用團隊的指導下，使用MxFE樣片進行原型設計非常容易。
測得的FWHM和SNR說明MxFE ADC的卓越時間精度和雜訊性能。市面上MxFE的採樣速率最高達到10 GSPS，可支援彈性設計下一代品質精度和品質解析度更好、靈敏度更高、尺寸更精巧的TOF MS。此外，MxFE ADC由於受到電源、時脈和驅動器產品的支援，將有助於確保實現無縫系統的整合和優化。
參考電路
1Jurgen H. Gross。質譜測定：教科書，第三版。Springer，2017年。
2Eva Torres-Sangiao、Cristina Leal Rodriguez 和 Carlos Garcia-Riestra。「MALDI–TOF質譜測定在臨床微生物實驗室中的應用和展望」。Microorganisms，第9卷，2021年。
3Mohammad Y. Ashfaq、Dana A. Da'na和Mohammad A. Al-Ghouti。“MALDI-TOF MS的環境細菌鑑定應用綜述”。Journal of Environmental Management，第305卷，2022年。
4E. Chabriere、H. Bassène、M. Drancourt和C. Sokhna。「MALDI-TOF MS和即時檢測(PoC)是非洲的顛覆性診斷工具」。New Microbe and New Infections，第26卷，2018年。
5 Chun C. Lee。學位論文：提高流水線型類比數位轉換器的精度和能效。密西根大學，2010年。
